Uji Kesesuaian Sistem Analisis

Beberapa hal yang menyangkut analisis khususnya kromatografi antara lain validasi metode analisis dan uji kesesuaian system. Uji kesesuaian sistem ini memang harus dilakukan secara rutin karena mempunyai tujuan untuk menentukan bahwa apakah sistem analisis beroperasi secara benar atau tidak.

Menurut  Farmakope Amerika, suatu sistem dikatakan sesuai jika memenuhi persyaratan presisi dan salah satu uji seperti resolusi (daya pisah), presisi, faktor asimetri puncak, efisiensi kolom dan faktor kapasitas.

Uraian mengenai parameter-parameter untuk uji kesesuaian sistem terinci sebagai berikut :

A.   A. Resolusi (daya pisah)

Dalam kromatografi gas (GC) dan kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC), resolusi didefinisikan sebagai perbedaan antara waktu retensi 2 puncak yang saling berdekatan (Δt_R = t_R2-t_R1) dibagi dengan rata-rata lebar puncak (W₁ + W₂)/2 seperti gambar berikut.

Nilai Rs harus mendekati atau lebih dari 1,5 karena akan memberikan pemisahan puncak yang baik (base line resolution).

Sedangkan untuk kromatografi lapis tipis (KLT) atau elektroforesis planar, resolusi dapat dihitung dengan:

Yang mana:

d                  : jarak antar 2 pusat zona

W₁ dan W₂     : rata-rata lebar zona

B. Penentuan Sistem Presisi

Setelah larutan baku diinjeksikan beberapa kali, simpangan baku relatif (relative Standard deviation, RSD) respon puncak dapat diukur, baik sebagai tinggi puncak atau luas puncak. Menurut monograp Farmakope Amerika, selain dinyatakan lain, sebanyak 5 kali injeksi harus dilakukan jika dinyatakan nilai RSD yang disyaratkan adalah ≤ 2,0 %; sementara itu jika dinyatakan nilai RSD boleh lebih besar dari 2,0 %, maka dilakukan 6 kali replikasi injeksi.

C. Faktor asimetri (Faktor pengekoran)

Menghitung besarnya TF pada kromatogram

Jika puncak yang akan dikuantifikasi adalah asimetri (tidak setangkup), maka suatu perhitungan asimetrisitas merupakan cara yang berguna untuk mengontrol atau mengkarakterisasi sistem kromatografi. Puncak asimetri muncul karena berbagai factor. Peningkatan puncak yang asimetri akan menyebabkan penurunan resolusi, batas deteksi, dan presisi.

Gambar tersebut menunjukkan bagaimana menghitung nilai faktor pengekoran (tailing factor, TF). Kromatogram yang memberikan harga TF =1 menunjukkan bahwa kromatogram tersebut bersifat setangkup atau simetris. Harga TF > 1 menunjukkan bahwa kromatogram mengalami pengekoran (tailing).  Semakin besar harga TF maka kolom yang dipakai semakin kurang efisien. Dengan demikian harga TF dapat digunakan untuk melihat efisiensi kolom kromatografi.

D. Efisiensi Kolom 
Ukuran efisiensi  kolom adalah jumlah lempeng (plate number, N) yang didasarkan pada konsep lempeng teoritis pada distilasi. Jumlah lempeng (N) dihitung dengan:

Yang mana:

t_R       : waktu retensi solut

σ_t       : simpangan baku lebar puncak

W_h/2    : lebar setengah tinggi puncak

W_b      : lebar dasar puncak
Gambar dibawah menjelaskan bagaimana cara menghitung t_R; W_h/2; W_b; dan σ suatu puncak kromatogram.

Waktu

Cara mengukur  t_R; W_h/2; W_b; dan σ suatu puncak kromatogram.

E. Kapasitas kolom
Faktor kapasitas kolom dirumuskan dengan:
Yang mana:

k’ = faktor kapasitas

t_R = merupakan waktu retensi solut; tM = waktu retensi fase gerak (waktu retensi solut yang tidak tertahan sama sekali).

Volume retensi yang bersesuaian juga dapat digunakan karena volume retensi berbanding lurus dengan waktu retensi. Volume retensi kadang-kadang terpilih dibanding waktu retensi karena tR bervariasi dengan kecepatan alir. Volume retensi selanjutnya dihitung dengan rumus:

V = (V_r-V_m)/V_m

Yang mana V_r= volume retensi solut; V_m = volume retensi fase gerak (waktu retensi solut yang tidak tertahan sama sekali).

Berbagai metode untuk menentuakan kapasitas kolom telah diusulkan antara lain untuk KLT:

k’ = (1-R_f)/R_f

Yang mana Rf merupakan jarak yang ditempuh oleh analit terhadap jarak fase geraknya atau:

           Jarak yang ditempuh solut

Rf = -------------------------------------

       Jarak yang ditempuh fase gerak

Read More

Ketahanan (Robutness)

Ketahanan merupakan kapasitas metode analisis untuk tetap tidak terpengaruh oleh adanya variasi parameter metode yang kecil. Ketahanan dievaluasi dengan melakukan variasi parameter-parameter metode seperti: persentase pelarut organik, pH, kekuatan ionik, suhu, dan sebagainya. Suatu praktek yang baik untuk mengevaluasi Ketahanan suatu metode adalah dengan memvariasi parameter-parameter penting dalam suatu metode secara sistematis lalu mengukur pengaruhnya pada pemisahan. Sebagai contoh, jika suatu metode menggunakan asetonitril 36%-air sebagai fase geraknya, maka seorang analis lalu memvariasi persentase asetonitrilnya menjadi misalkan 33, 36, dan 39% lalu melihat pengaruhnya pada waktu retensi analit yang diuji.6)

Protokol Validasi Metodenya
Rubahlah sedikit parameter-parameter pemisahan yang meliputi persentase pelarut organik (± 2 sampai 5 %), kemiringan gradien yang digunakan (dengan 2 sampai 5 %), suhu kolom (± 1 sanpai 50C), pH bufer (sampai ± 0,5 unit pH), kekuatan ionik bufer, konsentrasi bahan-bahan tambahan dalam larutan bufer dalam fase gerak. Kromatogram yang representatif harus disiapkan untuk menunjukkan pengaruh-pengaruh variabel yang diukur dibandingkan dengan kondisi normal. Plotkan atau buatlah tabel hasil-hasil uji (faktor respon, nilai yang diukur, dll).
Metode harus cukup kuat terkait dengan semua parameter kritis sehingga memungkinkan untuk digunakan analisis secara rutin.

Read More

Elemen Data untuk Uji Validasi

Farmakope Amerika (United States Pharmacopeia, USP)  maupun ICH (International Conference on Harmanization) telah memperkenalkan bahwa tidak selamanya parameter untuk mengevaluasi validasi metode perlu diuji.
USP membagi metode-metode analisis ke dalam 3 kategori yang terpisah, yaitu:
1. Penentuan kuantitatif komponen-komponen utama atau bahan aktif
2. Penentuan pengotor (impurities) atau produk-produk hasil degradasi
3. Penentuan karakteristik-karakteristik kinerja
4. Pengujian identifikasi

Untuk uji kategori 1, evaluasi nilai LOD dan LOQ tidak begitu penting karena komponen utama atau bahan aktif pada umumnya berada dalam jumlah yang besar.
Pengujian kategori 2 dapat dibagi lagi menjadi 2 sub-kategori, yaitu analisis kuantitatif dan uji batas. Jika yang diharapkan adalah informasi kuantitatifnya maka parameter LOD tidak begitu penting, tetapi parameter yang lain dibutuhkan. Keadaan yang berlawanan berlaku untuk uji batas, karena informasi kuantitatifnya tidak dibutuhkan maka pengukuran LOD, spesifisitas, dan kekasaran sudah mencukupi. Untuk mengetahui elemen-elemen data yang dibutuhkan untuk uji validasi dapat dilihat pada tabel berikut :

Sementara itu karakteristik validasi menurut ICH (International Conference on Harmanization) dan jenis prosedur analisisnya dapat dilihat pada table berikut :

Read More

Verifikasi Metode

Verifikasi metode pada dasarnya berbeda dengan validasi metode. Verifikasi metode dilakukan pada semua metode standar (metode baku) atau metode yang telah divalidasi pada waktu mula-mula digunakan dan pada jarak waktu tertentu secara berkala.

Tujuan verifikasi metode antara lain:

• Untuk memastikan bahwa analis dapat menerapkan metode analisis dengan baik.
• Untuk menjamin mutu hasil uji.

Verifikasi dilakukan dengan menetapkan presisi, akurasi, dan batas deteksi (jika perlu) pada suatu metode analisis. Penetapan presisi dapat dilakukan dengan salah satu pengujian berikut:

• Pengujian berulang pada sampel yang ada
• Pengujian berulang pada sampel formulasi sintetik
• Pengujian berulang pada bahan rujukan bersertifikat (CRM)

Penetapan akurasi sampel dapat dilakukan dengan salah satu pengujian berikut:

• Pengujian sampel dengan penambahan baku (spiking)
• Pengujian sampel yang telah diketahui komposisinya, yang secara tepat meniru jenis sampel yang menggunakan metode ini.

Read More

Kekasaran (Ruggedness)

Kekasaran (Ruggedness) merupakan tingkat reprodusibilitas hasil yang diperoleh di bawah kondisi yang bermacam-macam yang diekspresikan sebagai persen standar deviasi relatif (% RSD). Kondisi-kondisi ini meliputi laboratorium, analis, alat, reagen, dan waktu percobaan yang berbeda.
Kekasaran suatu metode mungkin tidak akan diketahui jika suatu metode dikembangkan pertama kali, akan tetapi kekasaran suatu metode akan kelihatan jika digunakan berulang kali. Suatu pengembangan metode yang bagus mensyaratkan suatu evaluasi yang sistematik terhadap faktor-faktor penting yang mempengaruhi kekasaran suatu metode.
 Strategi untuk menentukan kekasaran suatu metode akan bervariasi tergantung pada kompleksitas metode dan waktu yang tersedia untuk melakukan validasi. Penentuan kekasaran metode dapat dibatasi oleh kondisi-kondisi percobaan yang kritis, misalkan pengecekan pengaruh kolom kromatografi yang berbeda (pabrik dan jenisnya sama) atau pengaruh-pengaruh operasionalisasi metode pada laboratorium yang berbeda. Dalam kasus seperti ini, semua faktor harus dijaga konstan seperti fase gerak dan reagen-reagen yang digunakan.

Protokol validasi metodenya :Dengan cara yang serupa dengan studi stabilitas, larutan baku senyawa obat dengan matriksnya harus dianalisis secara sistematis dengan memvariasi kondisi-kondisi operasional. Nilai terukur senyawa dan pengaruh-pengaruhnya pada akurasi, presisi, dan faktor-faktor pemisahan harus dicatat.

Kondisi-kondisi yang diuji harus mencakup :

a. Operator-operator yang berbeda pada laboratorium yang sama
b. Alat-alat yang berbeda pada laboratorium yang sama
c. Laboratorium-laboratorium yang berbeda
d. Pengubahan sumber reagen dan pelarut
e. Pengubahan kolom dengan yang baru (dengan jenis dan pabrik pembuat yang sama)

Metode harus cukup kasar terkait dengan semua parameter kritis sehingga memungkinkan untuk digunakan analisis secara rutin.

Ref :
Snyder, L. R., Kirkland, S.J., and Glajch, J.L., 1997, Practical HPLC Method Development, John Wiley & Son, New York.

Read More

Validasi Metode

Saat ini ada banyak metode analisis kimia yang dikembangkan, baik itu mengacu dari Farmakope, Materia Medika ataupun jurnal dari hasil penelitian. Salah satu metode yang dikembangkan saat ini adalah metode kromatografi.
Berbagai hal yang terkait dengan kromatografi antara lain adalah bagaimana menentukan validasi metode dengan benar agar didapat hasil analisis yang paling baik. Bagian spesifik dari bab ini menggambarkan cara validasi metode analisis sediaan/senyawa dengan metode kromatografi.
Ada beberapa jenis kromatografi yang dikembangkan sesuai dengan acuan Farmakope antara lain :

1. Column Chromatography (CC)
2. Vacuum Liquid Chromatography (VLC)
3. Paper Chromatography (PC)
4. Thin Layer Chromatography (TLC)
5. High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
6. Gas Chromatography (GC)

Untuk memperoleh hasil analisis yang paling baik maka haruslah mempertimbangkan semua variabel yang terkait dengan metode analisis. Variabel tersebut antara lain prosedur pengambilan sampel, tahap penyiapan sampel, jenis penjerap yang digunakan pada kromatografi, fase gerak, dan sistem deteksinya. Banyaknya parameter yang harus divalidasi tergantung pada tujuan analisis. Bagian ini membahas validasi yang difokuskan pada metode kromatografi yang antara lain :

Read More

Akurasi

Akurasi merupakan kedekatan antara nilai terukur (nilai rata-rata hasil analisis) dengan nilai yang diterima sebagai nilai sebenarnya, baik nilai konvensi, nilai sebenarnya, ataupun nilai rujukan. Nilai akurasi juga dapat dijadikan sebagai petunjuk kesalahan sistematik.
Akurasi diukur sebagai banyaknya analit yang diperoleh kembali pada suatu pengukuran dengan melakukan spiking pada suatu sampel. Untuk pengujian senyawa obat, akurasi diperoleh dengan membandingkan hasil pengukuran dengan bahan rujukan standar (standard reference material, SRM).
Untuk mendokumentasikan akurasi, ICH merekomendasikan pengumpulan data dari 9 kali penetapan kadar dengan 3 konsentrasi yang berbeda (misal 3 konsentrasi dengan 3 kali replikasi). Data harus dilaporkan sebagai persentase perolehan kembali. Nilai rata-rata perolehan kembali sediaan obat seharusnya antara 98-102 % dari nilai teoritis.

Contoh protokol validasi metodenya :
Ke dalam larutan matriks blanko suatu tablet (yang mengandung semua bahan tambahan kecuali senyawa obat) di-spiking dengan senyawa obat pada level 50, 75,100, 125, dan 150 % dari target konsentrasi obat yang akan dianalisis. Prosedur ini harus dilakukan paling tidak 3 kali menggunakan matriks blangko yang disiapkan secara terpisah dari senyawa obat dan lebih terpilih jika dilakukan dalam 2 hari atau lebih. Hasil analisis dengan KCKT harus dibandingkan dengan baku senyawa uji yang ditambahkan pada masing-maisng level spiking.

Rata-rata perolehan kembali (recovery) analit harus antara 99 – 101 % pada tiap level.

Referensi :

1. Swartz, M.E., and Krull, I.S., 1997, Analytical Method Development and Validation, Marcell Dekker, USA.
2. Snyder, L. R., Kirkland, S.J., and Glajch, J.L., 1997, Practical HPLC Method Development, John Wiley & Son, New York.

Read More

Presisi (Kesalahan random)

Presisi merupakan ukuran kedekatan antar serangkaian hasil analisis yang diperoleh dari beberapa kali pengukuran pada sampel homogen yang sama. Konsep presisi diukur dengan simpangan baku. Presisi dapat dibagi lagi menjadi 2 atau 3 kategori. Komisi Eropa membagi presisi ke dalam keterulangan (repeatibility) dan ketertiruan (reproducibility). Keterulangan merupakan presisi pada kondisi percobaan yang sama (berulang) baik orangnya, peralatannya, tempatnya, dan dilakukan dalam interval waktu yang pendek. Keterulangan sering dirujuk sebagai pengukur. Ketertiruan menggambarkan presisi yang dilakukan pada percobaan yang berbeda, baik orangnya, peralatannya, tempatnya, maupun waktunya.

FDA (Food and Drug Administration), suatu badan pengawas obat dan makanan di Amerika, selain dengan keterulangan dan ketertiruan, juga menggunakan istilah presisi antara (intermediate precision) untuk menggambarkan presisi yang dilakukan dengan salah satu aspek yang berbeda, misal alatnya sama tapi analisnya berbeda, dan sebagainya.

Standar deviasi ketertiruan (reprodusibilitas) pada umumnya 2-3 kali lebih besar dibanding standar deviasi keterulangan (repitibilitas). Presisi akan menurun dengan menurunnya konsentrasi. Ketergantungan ini dirumuskan dengan:

RSD = 2(1-0,5exp logC)

Yang mana RSD (standar deviasi relatif dinyatakan dalam persen); dan C = konsentrasi analit.
Kisaran konsentrasi dalam sediaan farmasi biasanya antara 0,001-1 karenanya nilai RSD untuk keterulangan harus lebih kecil dari 1 %, dan RSD untuk reprodusibiltas kurang dari 2 %.

Contoh protokol validasi metodenya :
Presisi: Pengulangan injeksi

Siapkan larutan baku senyawa obat (lebih terpilih dalam pelarut fase gerak). Injeksikan suatu sampel larutan baku paling sedikit 10 kali (lebih terpilih jika dilakukan injeksi lebih dari 10 kali, misalkan 30-40 kali). Hitunglah respon masing-masing injeksi dan hitunglah RSD-nya.
Nilai standar deviasi relatif (RSD) respon ≤ 1,0 %.
Presisi: Pengulangan (antar pengujian)
Secara individual, siapkan larutan senyawa obat dengan konsentrasi yang berbeda-beda (lebih terpilih dalam pelarut fase gerak). Injeksikan masing-masing sampel 3 kali (lebih terpilih jika dilakukan injeksi lebih dari 10 kali , misalkan 30-40 kali). Hitunglah respon masing-masing injeksi dan hitunglah RSD-nya.
Nilai standar deviasi relatif (RSD) respon ≤ 2,0 %.

Presisi: antara
Ujilah suatu sampel senyawa obat beberapa kali dalam kisaran waktu yang berbeda, paling tidak dalam beberapa hari (lebih terpilih dalam pelarut fase gerak). Uji juga larutan baku yang sesuai dan gunakanlah kondisi percobaan yang sama akan tetapi analis, alat, dan lain-lain yang digunakan berbeda. Hitunglah nilai uji masing-masing sampel dan hitunglah presisinya.
Nilai standar deviasi relatif (RSD) harus ≤ 2,0 %.

Referensi :

1. Adamovics, J.A., 1997, Chromatographic Analysis of Pharmaceuticals, 2nd Edition, Marcel Dekker, New York.
2. Swartz, M.E., and Krull, I.S., 1997, Analytical Method Development and Validation, Marcell Dekker, USA.

Read More

Batas Pengukuran

Ada 2 kategori terkait dengan batas pengukuran. Yang pertama adalah batas deteksi (limit of detection) dan yang kedua adalah batas kuantifikasi (limit of quantification).

Batas deteksi didefinisikan sebagai konsentrasi analit terendah dalam sampel yang masih dapat dideteksi, meskipun tidak selalu dapat dikuantifikasi. LOD merupakan batas uji yang secara spesifik menyatakan apakah analit di atas atau di bawah nilai tertentu. Sebagai contoh, batas deteksi merupakan banyaknya sampel yang menunjukkan respon (S) 3 kali terhadap derau (N) atau LOD = 3 S/N.

Batas kuantifikasi didefinisikan sebagai konsentrasi analit terendah dalam sampel yang dapat ditentukan dengan presisi dan akurasi yang dapat diterima pada kondisi operasional metode yang digunakan. Sebagaimana LOD, LOQ juga diekspresikan sebagai konsentrasi (dengan akurasi dan presisi juga dilaporkan). Kadang-kadang rasio signal to noise 10: 1 digunakan untuk menentukan LOQ. Perhitungan LOQ dengan rasio signal to noise 10: 1 merupakan aturan umum, meskipun demikian perlu diingat bahwa LOQ merupakan suatu kompromi antara konsentrasi dengan presisi dan akurasi yang dipersyaratkan. Jadi, jika konsentrasi LOQ menurun maka presisi juga menurun. Jika presisi tinggi dipersyaratkan, maka konsentrasi LOQ yang lebih tinggi harus dilaporkan.

Protokol Validasi Metode
Contoh protokol ini adalah pengujian senyawa obat dalam sediaan tablet dengan HPLC fase terbalik. Meskipun demikian, prinsip-prinsip umum dapat diaplikasikan untuk analisis yang lain dan metode yang lain, misalnya pengujian kemurnian suatu obat dengan HPLC, dan juga penentuan pengotor dalam jumlah sekelumit dengan HPLC dan GC.

Caranya :
Dengan menggunakan larutan baku senyawa obat yang menghasilkan rasio signal to noise (S/N) paling sedikit 30, lakukan pengenceran sampel dan buatlah pengukuran berlipat (paling sedikit 6 kali injeksi masing-masing larutan yang konsentrasinya berbeda) dengan metode analisis, misalkan dengan HPLC. Lanjutkan proses ini sampai salah satu keadaan berikut terjadi:

a. Rasio S/N kurang lebih 10.
b. Presisi (SD) terhitung untuk serangkaian 6 pengukuran ≤ 3%.

Referensi :

1. Swartz, M.E., and Krull, I.S., 1997, Analytical Method Development and Validation, Marcell Dekker, USA.
2. Snyder, L. R., Kirkland, S.J., and Glajch, J.L., 1997, Practical HPLC Method Development, John Wiley & Son, New York.

Read More

Linieritas

Linieritas merupakan kemampuan suatu metode untuk memperoleh hasil-hasil uji yang secara langsung proporsional dengan konsentrasi analit pada kisaran yang diberikan. Linieritas suatu metode merupakan ukuran seberapa baik kurva kalibrasi yang menghubungkan antara respon (y) dengan konsentrasi (x).

Evaluasi linieritas paling baik dicirikan dengan metode uji kurva respon. Suatu alur yang menyatakan hubungan antara konsentrasi analit dengan responnya seringkali linier pada konsentrasi tertentu.

Linieritas dapat diukur dengan melakukan pengukuran tunggal pada konsentrasi yang berbeda-beda. Data yang diperoleh selanjutnya diproses dengan metode kuadrat terkecil, untuk selanjutnya dapat ditentukan nilai kemiringan (slope), intersep, dan koefisien korelasinya.

Pengujian komponen utama (bahan aktif dalam jumlah banyak) suatu sediaan :
Karakteristik ini haruslah dievaluasi sebagai bagian dari studi akurasi di atas. Linieritas dapat diuji dengan menyiapkan larutan baku senyawa obat sendiri, lebih terpilih jika menggunakan fase geraknya sebagai pelarut pada kisaran konsentrasi analisis rutin. Suatu kisaran yang diperluas dapat juga diuji (misalkan <50 % dan >150 % dari target konsentrasi analit) jika diharapkan untuk jenis analisis yang lain.

Metode harus menunjukkan linieritas dalam kisaran yang diharapkan. Linieritas harus diukur dan dilaporkan sebagai suatu konstanta faktor respon pada kisaran pengukuran-pengukuran yang diharapkan.

Referensi :

1. Snyder, L. R., Kirkland, S.J., and Glajch, J.L., 1997, Practical HPLC Method Development, John Wiley & Son, New York.
2. Chan, C.C., Lam, H., Lee, Y.C., and Zhang, X-M., 2004, Analytical Method Validation and Instrument performance Verification, Wiley Interscience, A John Wiley and Sons, New York, USA.
   

Read More

Spesifisitas

Spesifisitas suatu metode analisis adalah kemampuan suatu metode analisis untuk mengukur analit yang dituju secara tepat dan spesifik dengan adanya komponen-komponen lain dalam matriks sampel seperti adanya penganggu, prekursor sintetik, produk degradasi, dan komponen matriks. Dalam teknik pemisahan, daya pisah (resolusi) antara analit yang dituju dengan penganggu lainnya harus >1,5.
ICH membagi spesifisitas dalam 2 kategori, yakni uji identifikasi dan uji kemurnian atau pengukuran. Untuk tujuan identifikasi, spesifisitas ditunjukkan dengan kemampuan suatu metode analisis untuk membedakan antar senyawa yang mempunyai struktur molekul yang hampir sama. Untuk tujuan uji kemurnian dan tujuan pengukuran kadar, spesifisitas ditunjukkan oleh daya pisah 2 senyawa yang berdekatan (sebagaimana dalam kromatografi). Senyawa-senyawa tersebut biasanya adalah komponen utama atau komponen aktif dan atau suatu pengotor. Jika dalam suatu uji terdapat suatu pengotor (impurities) maka metode uji harus tidak terpengaruh dengan adanya pengotor ini.

Salah satu pendekatan praktek untuk menguji spesifisitas metode analisis adalah dengan membandingkan hasil-hasil analisis yang diperoleh dari sampel yang mengandung pengotor (impurities) dengan sampel-sampel yang mengandung pengotor (impurities). Bias uji merupakan perbedaan hasil antara kedua uji. Asumsi pendekatan ini adalah bahwa semua penganggu telah diketahui oleh analis dan tersedia untuk kajian spiking.

Penentuan spesifisitas metode dapat diperoleh dengan 2 jalan :
Yang pertama (yang paling diharapkan), adalah dengan melakukan optimasi sehingga diperoleh senyawa yang dituju terpisah secara sempurna dari senyawa-senyawa lain (resolusi senyawa yang dituju ≥ 2).
Cara kedua untuk memperoleh spesifisitas adalah dengan menggunakan detektor selektif, terutama untuk senyawa-senyawa yang terelusi secara bersama-sama. Sebagai contoh, detektor elektrokimia atau detektor fluoresen hanya akan mendeteksi senyawa tertentu, sementara senyawa yang lainnya tidak terdeteksi. Penggunaan detektor UV pada panjang gelombang yang spesifik juga merupakan cara yang efektif untuk melakukan pengukuran selektifitas. Deteksi analit secara selektif dengan detektor UV dapat ditingkatkan dengan menggunakan teknik derivatisasi dan dilanjutkan dengan pengukuran pada panjang gelombang tertentu yang spesifik terhadap derivat yang dihasilkan. Sebagai contoh adalah penggunaan senyawa 4-dimetilaminoazobenzen-4’-sulfonil klorida (DABS-Cl) untuk menderivatisasi asam amino yang mana derivat yang terbentuk dapat dideteksi dengan UV pada panjang gelombang 436 nm.

Contoh protokol validasi metode seperti ini :
1. Injeksikan sampel yang mengandung analit dan semua senyawa-senyawa yang terkait dengan analit. Senyawa-senyawa ini juga meliputi kontaminan, reagen-reagen, prekursor sintetik, dan hasil-hasil degradasi yang paling mungkin ada dalam reaksi. Semua senyawa yang dipisahkan dari puncak analit harus mempunyai Resolusi (Rs) ≥ 2.

2. Injeksikan sampel dan bahan-bahan tambahan lain (misalkan yang digunakan dalam suatu sediaan tablet). Semua senyawa yang dipisahkan dari puncak analit harus mempunyai Resolusi (Rs) ≥ 2.

3. Perlakukan bahan aktif atau senyawa obat pada kondisi-kondisi berikut (supaya waktunya efisien) sehingga suatu obat akan terdegradasi 10-30 %. 

• HCl 0,1 N (kondisi asam) 
• NaOH 0,1 N (kondisi basa)
• Dipanaskan sampai 500 drjtC
• Disinari dengan lampu ultraviolet
• Ditambah dengan larutan hidrogen peroksida 3%

         Jika kondisi-kondisi perubahan berlangsung sangat ekstrim (degradasinya > 30%), maka faktor-faktor yang menyebabkan degradasi haeus diturunkan. Kondisi-kondisi ekstrim harus dihindari, kecuali jika senyawa tersebut akan diperlakukan pada keadaan ekstrim.
Semua senyawa yang dipisahkan dari puncak analit harus mempunyai Resolusi (Rs) ≥ 2.

4. Kumpulkan puncak analit senyawa obat yang dituju, lalu :

• sampel diinjeksikan kembali pada kromatografi yang berbeda (misalkan dengan TLC, GC, elektroforesis, dll)
• Puncak dianalisis dengan menggunakan teknik spektra yang lain (IR, MS, NMR,dll)
• Tidak ada bukti munculnya senyawa lain

5. Kumpulkan puncak analit senyawa obat dalam 3 bagian (awal, tengah, dan akhir) dan lakukan analisis lagi dengan HPLC.
Tidak ada bukti munculnya (bentuk puncak) senyawa-senyawa tambahan.

6. Rubahlah kondisi-kondisi metode KCKT (persen pelarut organik dalam fase terbalik, jenis pelarut, kemiringan gradien dalam elusi bergradien, suhu, kekuatan ionik dan atau bufer) dan lihatlah puncak-puncak tambahan yang terpisah dari puncak analit.
Tidak ada bukti munculnya (bentuk puncak ) senyawa-senyawa tambahan.

Referensi :
Swartz, M.E., and Krull, I.S., 1997, Analytical Method Development and Validation, Marcell Dekker, USA.

Read More

Tujuan Validasi Metode

Tujuan utama validasi metode adalah untuk menghasilkan hasil analisis yang paling baik. Untuk memperoleh hasil tersebut, semua variabel yang terkait dengan metode analisis harus dipertimbangkan seperti prosedur pengambilan sampel, tahap penyiapan sampel, jenis penjerap yang digunakan pada kromatografi, fase gerak, dan sistem deteksinya. Banyaknya parameter yang harus divalidasi tergantung pada tujuan analisis. Pada bagian ini, pembahasan validasi difokuskan pada metode kromatografi.

Prosedur analisis mempunyai 4 tujuan utama yaitu :

1. analisis kuantitatif komponen-komponen utama atau bahan aktif.
2. penentuan pengotor (impurities) atau produk-produk hasil degradasi.
3. penentuan karakteristik-karakteristik kinerja.
4. uji identifikasi.

Sedangkan gambaran mengenai karakteristik kinerja yang harus dievaluasi untuk jenis-jenis prosedur analisis yang umum adalah :

1. Akurasi
2. Presisi (Repeatibilitas dan Presisi antara)
3. Spesifisitas
4. LOD (limit of detection)
5. LOQ (limit of quantification)
6. Linieritas

Tabel karakteristik validasi dan jenis prosedur analisisnya sebagai berikut :

Read More

Proses Validasi Metode

Validasi merupakan suatu proses yang terdiri atas paling tidak 4 langkah nyata, yaitu:
(1) validasi perangkat lunak (software validation),
(2) validasi perangkat keras/instrumen (instrument/hardware validation),
(3) validasi metode, dan
(4) kesesuaian sistem (system suitability).

Proses validasi dimulai dengan perangkat lunak yang tervalidasi dan sistem yang terjamin, lalu metode yang divalidasi menggunakan sistem yang terjamin dikembangkan. Akhirnya, validasi total diperoleh dengan melakukan kesesuaian sistem. Masing-masing tahap dalam proses validasi ini merupakan suatu proses yang secara keseluruhan bertujuan untuk mencapai kesuksesan validasi.

            Kualifikasi merupakan bagian (subset) proses validasi yang akan memverifikasi modul dan kinerja sistem sebelum suatu instrumen diletakkan secara on line (atau diletakkan pada tempatnya dalam suatu laboratorium). Jika instrumen tidak terjamin dengan baik sebelum digunakan, maka akan muncul suatu masalah yang sulit untuk diidentifikasi. Gambar diatas menjelaskan garis waktu kejadian-kejadian pada saat proses validasi.

 

Kualifikasi

Sebagaimana dijelaskan oleh gambar diatas, validasi diawali dari sisi pemasok (vendor’s site) sebagai bagian terstruktur pada tahap validasi. Pada tahap ini, instrumen dan perangkat lunak dikembangkan, didesain, dan dihasilkan dalam suatu lingkungan yang tervalidasi sesuai dengan praktek laboratorium yang baik (good laboratory practices, GLP) dan atau standar ISO 9000. Selama tahap kualifikasi atau validasi fungsional, maka dilakukan kualifikasi instalasi (installation qualification, IQ), kualifikasi operasional (operational qualification, OQ), dan kualifikasi kinerja (performance qualification, PQ). Setelah instrumen diletakkan secara on line (atau diletakkan pada tempatnya dalam laboratorium) dan setelah instrumen digunakan dalam waktu tertentu maka alat harus dikalibrasi dan dilakukan standardisasi, yang mana proses seperti ini kadang-kadang dirujuk sebagai kualifikasi perawatan (maintenance qualification, MQ). 

1. Kualifikasi instalasi (installation qualification, IQ)   

Proses IQ dapat dibagi menjadi 2 langkah yaitu pre-instalasi dan instalasi fisik. Selama pre-instalasi, semua informasi yang berhubungan dengan instalasi yang benar, operasionalisasi, dan perawatan instrumen harus dikaji. Selama instalasi fisik, nomer seri harus dicatat. Dokumentasi yang menggambarkan bagaimana instrumen diinstal, siapa yang melakukan instalasi, dan rincian-rincian lain yang terkait dengan instrumen harus diarsipkan.

2. Kualifikasi operasional (operational qualification, OQ)
   

Proses OQ menjamin bahwa modul-modul yang menjelaskan secara spesifik sistem operasional instrumen telah sesuai dengan spesifikasi yang ditentukan, misal akurasinya, linieritasnya, dan presisinya. Proses ini mungkin merupakan suatu verifikasi terhadap modul itu sendiri.

3. Kualifikasi kinerja (performance qualification, PQ)
   

Proses PQ memverifikasi kinerja sistem. Uji PQ dilakukan di bawah kondisi penggunaan instrumen yang sebenarnya pada kisaran kerja yang telah diantisipasi. Meskipun demikian, pada prakteknya antara OQ dan PQ seringkali dilakukan secara bersama-sama khususnya untuk uji linieritas dan presisi (repitibilitas atau keterulangan).

Read More