Uji Kesesuaian Sistem Analisis

Beberapa hal yang menyangkut analisis khususnya kromatografi antara lain validasi metode analisis dan uji kesesuaian system. Uji kesesuaian sistem ini memang harus dilakukan secara rutin karena mempunyai tujuan untuk menentukan bahwa apakah sistem analisis beroperasi secara benar atau tidak.

Menurut  Farmakope Amerika, suatu sistem dikatakan sesuai jika memenuhi persyaratan presisi dan salah satu uji seperti resolusi (daya pisah), presisi, faktor asimetri puncak, efisiensi kolom dan faktor kapasitas.

Uraian mengenai parameter-parameter untuk uji kesesuaian sistem terinci sebagai berikut :

A.   A. Resolusi (daya pisah)

Dalam kromatografi gas (GC) dan kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC), resolusi didefinisikan sebagai perbedaan antara waktu retensi 2 puncak yang saling berdekatan (Δt_R = t_R2-t_R1) dibagi dengan rata-rata lebar puncak (W₁ + W₂)/2 seperti gambar berikut.

Nilai Rs harus mendekati atau lebih dari 1,5 karena akan memberikan pemisahan puncak yang baik (base line resolution).

Sedangkan untuk kromatografi lapis tipis (KLT) atau elektroforesis planar, resolusi dapat dihitung dengan:

Yang mana:

d                  : jarak antar 2 pusat zona

W₁ dan W₂     : rata-rata lebar zona

B. Penentuan Sistem Presisi

Setelah larutan baku diinjeksikan beberapa kali, simpangan baku relatif (relative Standard deviation, RSD) respon puncak dapat diukur, baik sebagai tinggi puncak atau luas puncak. Menurut monograp Farmakope Amerika, selain dinyatakan lain, sebanyak 5 kali injeksi harus dilakukan jika dinyatakan nilai RSD yang disyaratkan adalah ≤ 2,0 %; sementara itu jika dinyatakan nilai RSD boleh lebih besar dari 2,0 %, maka dilakukan 6 kali replikasi injeksi.

C. Faktor asimetri (Faktor pengekoran)

Menghitung besarnya TF pada kromatogram

Jika puncak yang akan dikuantifikasi adalah asimetri (tidak setangkup), maka suatu perhitungan asimetrisitas merupakan cara yang berguna untuk mengontrol atau mengkarakterisasi sistem kromatografi. Puncak asimetri muncul karena berbagai factor. Peningkatan puncak yang asimetri akan menyebabkan penurunan resolusi, batas deteksi, dan presisi.

Gambar tersebut menunjukkan bagaimana menghitung nilai faktor pengekoran (tailing factor, TF). Kromatogram yang memberikan harga TF =1 menunjukkan bahwa kromatogram tersebut bersifat setangkup atau simetris. Harga TF > 1 menunjukkan bahwa kromatogram mengalami pengekoran (tailing).  Semakin besar harga TF maka kolom yang dipakai semakin kurang efisien. Dengan demikian harga TF dapat digunakan untuk melihat efisiensi kolom kromatografi.

D. Efisiensi Kolom 
Ukuran efisiensi  kolom adalah jumlah lempeng (plate number, N) yang didasarkan pada konsep lempeng teoritis pada distilasi. Jumlah lempeng (N) dihitung dengan:

Yang mana:

t_R       : waktu retensi solut

σ_t       : simpangan baku lebar puncak

W_h/2    : lebar setengah tinggi puncak

W_b      : lebar dasar puncak
Gambar dibawah menjelaskan bagaimana cara menghitung t_R; W_h/2; W_b; dan σ suatu puncak kromatogram.

Waktu

Cara mengukur  t_R; W_h/2; W_b; dan σ suatu puncak kromatogram.

E. Kapasitas kolom
Faktor kapasitas kolom dirumuskan dengan:
Yang mana:

k’ = faktor kapasitas

t_R = merupakan waktu retensi solut; tM = waktu retensi fase gerak (waktu retensi solut yang tidak tertahan sama sekali).

Volume retensi yang bersesuaian juga dapat digunakan karena volume retensi berbanding lurus dengan waktu retensi. Volume retensi kadang-kadang terpilih dibanding waktu retensi karena tR bervariasi dengan kecepatan alir. Volume retensi selanjutnya dihitung dengan rumus:

V = (V_r-V_m)/V_m

Yang mana V_r= volume retensi solut; V_m = volume retensi fase gerak (waktu retensi solut yang tidak tertahan sama sekali).

Berbagai metode untuk menentuakan kapasitas kolom telah diusulkan antara lain untuk KLT:

k’ = (1-R_f)/R_f

Yang mana Rf merupakan jarak yang ditempuh oleh analit terhadap jarak fase geraknya atau:

           Jarak yang ditempuh solut

Rf = -------------------------------------

       Jarak yang ditempuh fase gerak

Posted in: Validasi