Spesifisitas

Spesifisitas suatu metode analisis adalah kemampuan suatu metode analisis untuk mengukur analit yang dituju secara tepat dan spesifik dengan adanya komponen-komponen lain dalam matriks sampel seperti adanya penganggu, prekursor sintetik, produk degradasi, dan komponen matriks. Dalam teknik pemisahan, daya pisah (resolusi) antara analit yang dituju dengan penganggu lainnya harus >1,5.
ICH membagi spesifisitas dalam 2 kategori, yakni uji identifikasi dan uji kemurnian atau pengukuran. Untuk tujuan identifikasi, spesifisitas ditunjukkan dengan kemampuan suatu metode analisis untuk membedakan antar senyawa yang mempunyai struktur molekul yang hampir sama. Untuk tujuan uji kemurnian dan tujuan pengukuran kadar, spesifisitas ditunjukkan oleh daya pisah 2 senyawa yang berdekatan (sebagaimana dalam kromatografi). Senyawa-senyawa tersebut biasanya adalah komponen utama atau komponen aktif dan atau suatu pengotor. Jika dalam suatu uji terdapat suatu pengotor (impurities) maka metode uji harus tidak terpengaruh dengan adanya pengotor ini.

Salah satu pendekatan praktek untuk menguji spesifisitas metode analisis adalah dengan membandingkan hasil-hasil analisis yang diperoleh dari sampel yang mengandung pengotor (impurities) dengan sampel-sampel yang mengandung pengotor (impurities). Bias uji merupakan perbedaan hasil antara kedua uji. Asumsi pendekatan ini adalah bahwa semua penganggu telah diketahui oleh analis dan tersedia untuk kajian spiking.

Penentuan spesifisitas metode dapat diperoleh dengan 2 jalan :
Yang pertama (yang paling diharapkan), adalah dengan melakukan optimasi sehingga diperoleh senyawa yang dituju terpisah secara sempurna dari senyawa-senyawa lain (resolusi senyawa yang dituju ≥ 2).
Cara kedua untuk memperoleh spesifisitas adalah dengan menggunakan detektor selektif, terutama untuk senyawa-senyawa yang terelusi secara bersama-sama. Sebagai contoh, detektor elektrokimia atau detektor fluoresen hanya akan mendeteksi senyawa tertentu, sementara senyawa yang lainnya tidak terdeteksi. Penggunaan detektor UV pada panjang gelombang yang spesifik juga merupakan cara yang efektif untuk melakukan pengukuran selektifitas. Deteksi analit secara selektif dengan detektor UV dapat ditingkatkan dengan menggunakan teknik derivatisasi dan dilanjutkan dengan pengukuran pada panjang gelombang tertentu yang spesifik terhadap derivat yang dihasilkan. Sebagai contoh adalah penggunaan senyawa 4-dimetilaminoazobenzen-4’-sulfonil klorida (DABS-Cl) untuk menderivatisasi asam amino yang mana derivat yang terbentuk dapat dideteksi dengan UV pada panjang gelombang 436 nm.

Contoh protokol validasi metode seperti ini :
1. Injeksikan sampel yang mengandung analit dan semua senyawa-senyawa yang terkait dengan analit. Senyawa-senyawa ini juga meliputi kontaminan, reagen-reagen, prekursor sintetik, dan hasil-hasil degradasi yang paling mungkin ada dalam reaksi. Semua senyawa yang dipisahkan dari puncak analit harus mempunyai Resolusi (Rs) ≥ 2.

2. Injeksikan sampel dan bahan-bahan tambahan lain (misalkan yang digunakan dalam suatu sediaan tablet). Semua senyawa yang dipisahkan dari puncak analit harus mempunyai Resolusi (Rs) ≥ 2.

3. Perlakukan bahan aktif atau senyawa obat pada kondisi-kondisi berikut (supaya waktunya efisien) sehingga suatu obat akan terdegradasi 10-30 %. 

• HCl 0,1 N (kondisi asam) 
• NaOH 0,1 N (kondisi basa)
• Dipanaskan sampai 500 drjtC
• Disinari dengan lampu ultraviolet
• Ditambah dengan larutan hidrogen peroksida 3%

         Jika kondisi-kondisi perubahan berlangsung sangat ekstrim (degradasinya > 30%), maka faktor-faktor yang menyebabkan degradasi haeus diturunkan. Kondisi-kondisi ekstrim harus dihindari, kecuali jika senyawa tersebut akan diperlakukan pada keadaan ekstrim.
Semua senyawa yang dipisahkan dari puncak analit harus mempunyai Resolusi (Rs) ≥ 2.

4. Kumpulkan puncak analit senyawa obat yang dituju, lalu :

• sampel diinjeksikan kembali pada kromatografi yang berbeda (misalkan dengan TLC, GC, elektroforesis, dll)
• Puncak dianalisis dengan menggunakan teknik spektra yang lain (IR, MS, NMR,dll)
• Tidak ada bukti munculnya senyawa lain

5. Kumpulkan puncak analit senyawa obat dalam 3 bagian (awal, tengah, dan akhir) dan lakukan analisis lagi dengan HPLC.
Tidak ada bukti munculnya (bentuk puncak) senyawa-senyawa tambahan.

6. Rubahlah kondisi-kondisi metode KCKT (persen pelarut organik dalam fase terbalik, jenis pelarut, kemiringan gradien dalam elusi bergradien, suhu, kekuatan ionik dan atau bufer) dan lihatlah puncak-puncak tambahan yang terpisah dari puncak analit.
Tidak ada bukti munculnya (bentuk puncak ) senyawa-senyawa tambahan.

Referensi :
Swartz, M.E., and Krull, I.S., 1997, Analytical Method Development and Validation, Marcell Dekker, USA.

Posted in: Validasi