Teknik Sampling Obat

Dalam banyak hal, sediaan obat tidak dapat dianalisis secara langsung dengan metode kromatografi tanpa didahului dengan tahap perlakuan/penyiapan sampel. Tahap ini pada umumnya dikelompokkan menjadi tahap pengambilan sampel (sampling) dan tahap pembersihan sampel (clean up). Tujuan akhir pengambilan sampel adalah untuk memperoleh sampel yang representatif (mewakili) dari suatu batch sediaan farmasi⁽¹⁾.

Cara pengambilan sampel (sampling) merupakan masalah yang sangat penting dalam analisis kimia sebab untuk mengetahui kadar atau konsentrasi suatu senyawa tertentu dalam sampel hanya dilakukan terhadap sejumlah kecil sampel. Oleh karena itu, cara pengambilan sampel yang salah meskipun metode analisisnya tepat dan teliti hasilnya tidak akan memberikan petunjuk yang benar mengenai sifat (dalam hal ini kadar) yang akan diselidiki. Meskipun demikian, masalah ini seringkali kurang mendapat perhatian dari seorang analis disebabkan para analis sudah terbiasa menerima sampel yang langsung dianalisis⁽²⁾.

Aturan umum yang pasti mengenai cara pengambilan sampel dan berapa besarnya sampel yang harus diambil tidak dapat dirumuskan secara umum sebab cara pengambilan sampel sangat tergantung pada sifat dan jumlah bahan yang dianalisis. Cara pengambilan sampel zat padat akan berbeda dengan cara pengambilan zat cair, dan akan berbeda pula dengan gas. Namun, pada prinsipnya sampel yang dianalisis harus bersifat representatif, artinya sampel yang akan dianalisis benar-benar mewakili populasinya⁽²⁾.

Berdasarkan prinsip ini dikenal dua macam cara pengambilan sampel dalam analisis kimia yaitu:

1. Pengambilan sampel random (cuplikan random, cuplikan acak)

Cara pengambilan sampel ini dilakukan terhadap bahan yang serba sama (homogen) atau dianggap serba sama. Misalnya larutan sejati, batch tablet, ampul dan sebagainya.

Serbuk sampel yang diterima analis untuk dianalisis harus dianggap bukan sampel yang homogen. Untuk dapat disampel secara random, harus terlebih dahulu digerus secara homogen. Begitu pula larutan/suspensi harus digojog sampai homogen, baru dilakukan pengambilan sampel secara random.

2. Pengambilan sampel representatif

Sampel yang dikirim ke laboratorium analisis untuk dilakukan pngujian harus representatif untuk menghindari resiko adanya hasil analisis yang keluar dari spesifikasi yang ditentukan. Cara ini dilakukan jika bahan yang akan dianalisis tidak homogen. Dalam hal ini, sampel harus diambil dari bagian-bagian yang berbeda-beda dari setiap wadah (bagian atas, tengah, bawah, samping, dan sebagainya). Masing-masing sampel harus dicampur homogen kemudian sampel diambil secara random untuk dianalisis⁽²⁾.

Pengambilan sample sediaan obat

• Sediaan-sediaan parenteral

Pada dasarnya sediaan parenteral sudah homogen. Untuk lot yang kecil (biasanya 3000 dos) dilakukan analisis 2 unit sediaan obat secara duplikat⁽¹⁾.

• Tablet dan Bentuk sediaan sejenis

Pencampuran suatu formulasi yang mengandung bahan aktif dengan bahan tambahan seringkali dilakukan dalam suatu ukuran lot yang mana proporsi kandungan bahan aktif terhadap massa total adalah kecil.

Sampel-sampel bentuk sediaan padat dapat diambil dengan melakukan pengujian unit individual atau suatu sample komposit dari unit-unit individual. Pengambilan sample pada suatu unit individual dilakukan ketika kisaran nilai dalam unit-unit terpisah adalah besar dan atau ketika diperlukan suatu keberagaman unit. Pengambilan sample komposit dilakukan ketika homogenitas bukalah suatu masalah yang berarti atau ketika keberagaman unit bukanlah sesuatu yang penting⁽¹⁾.           

• Sediaan-sediaan yang lain

Sediaan-sediaan seperti gel, lotion, dan suspensi sebelum dianalisis harus dicampur secara homogen.

Referensi:

1. Adamovics, J.A., 1997, Chromatographic Analysis of  Pharmaceuticals, 2^nd Edition, Marcel Dekker, New York.
2. Achmad, M., dan Abdul, R., 2006, Volumetri dan Gravimetri, Pustaka Pelajar, Yogyakarta.

Read More

Analisis Diazepam dalam Darah

Diazepam (Valium) merupakan turunan dari benzodiazepine dengan rumus molekul 7-choro-1,3-dihydro-1-methyl-5-phenyl-2H-1,4-benzodiazepin-2-on, rumus kimianya biasa ditulis dengan C₂₃H₂₇N. Senyawa golongan psikotropika ini berbentuk kristal agak kekuningan yang tidak larut air. Nama brand diazepam dalam sediaan tunggal antara lain Valium®, Valisanbe®, Validex® dan Stesolid® dengan kemasan 2 mg, 5 mg dan 10 mg. Ada juga dalam sediaan campuran/kombinasi seperti Metaneuron®, Danalgin® dan Neurodial®.

Diazepam termasuk obat  antiansietas, antikonvulsan, dan sedatif. Mempunyai Indikasi untuk status epileptikus, ansietas atau insomnia, konvulsi akibat keracunan, kejang demam, dan sebagai obat penenang.

Uji farmakokinetika menunjukkan absorpsi diazepam dengan cepat secara lengkap setelah pemberian peroral dengan konsentrasi puncak dalam plasma yang dicapai pada menit ke 15-90 pada dewasa dan menit ke-30 pada anak-anak. Bioavailabilitas obat dalam bentuk sediaan tablet adalah 100%. Range t_1/2­  diazepam antara 20-100 jam dengan rata-rata t_1/2­nya adalah 30 jam,  sedang waktu paruh bervariasi antara 20 - 50 jam.

Didalam tubuh, diazepam dimetabolisme menjadi metabolit aktif yaitu N-desmetildiazepam dan oxazepam. Sedang waktu paruh desmetil-diazepam bervariatif sampai 100 jam tergantung usia dan kondisi fungsi hati.

Cara penetapan kadar diazepam dalam darah adalah dengan menggunakan metode HPLC (High Performance Liquid Chromatography). Prinsip cara uji diazepam ini adalah dengan mengekstraksi menggunakan pelarut atau campuran pelarut yang sesuai. Kemudian sampel yang sudah melalui proses  preparasi selanjutnya diinjeksikan ke sistem HPLC.

Bahan Preparasi :

Rumus Bangun Diazepam

1. Bufer fosfat 10 mM, yang dibuat dengan melarutkan 680 mg KH₂PO₄ dalam 1 liter air, pH diatur 2,6 dengan menambah asam orto-fosfat pekat. 
2. Bufer ammonia, dibuat dengan ammonium sulfat jenuh yang diencerkan dengan air hingga konsentrasi 25% lalu pH-nya diatur 9,5 dengan ammonia 25%. 
3. Kloroform 
4. Isoropanol 
5. n-heptan 
6. Tetrahidrofuran (THF) 
7. Metanol 
8. Air

Peralatan yang dipakai :

1. Seperangkat alat HPLC 
2. Neraca analitik 
3. pH-meter 
4. Alat sentrifuge

Prosedur Penyiapan (preparasi) Larutan Sampel :

1. Sebanyak 2 mL darah atau 2 mL plasma ditambah dengan 2 mL buffer ammonia, 5 mL campuran kloroform-isopropanol-n-heptan dengan perbandingan 60:14:26.
2. Campuran digojog secara horizontal selama 10 menit, lalu disentrifus dengan kecepatan 2800 xg selama 10 menit.Lapisan organic (bagian bawah) dipindahkan dan diuapkan sampai kering di bawah vakum pada suhu 45⁰C.
3. Residu dilarutkan kembali dalam 100 μL fase gerak lalu disentrifus lagi dengan kecepatan 2800 xg selama 5 menit. 
4. Alikuot supernatannya diambil untuk diinjeksikan ke dalam system HPLC.

Cara Penetapan

1.  Dibuat kurva baku diazepam dengan menggunakan matriks plasma yang bebas diazepam pada kisaran konsentrasi 1-100 μg/mL atau pada kisaran konsentrasi yang memberikan reson detektor yang linier. 
2. Masing-masing konsentrasi diinjeksikan dengan sistem HPLC seperti dibawah dan diulangi sebanyak 3 kali.
3. Dihitung persamaan kurva baku y = a+bx; dimana y = luas kromatogram dan x = konsentrasi baku yang diinjeksikan.
4. Sebanyak 50 μL alikuot supernatan diinjeksikan ke dalam sistem HPLC dan dicatat luas kromatogramnya.
5. Injeksikan sampel dengan replikasi sebanyak 4 kali dan dihitung nilai rata-rata luas kromatogramnya.

Sistem kromatografi yang digunakan :

1. Kolom            : NovaPack C₁₈ (300 x 3,9 mm) 
2. Fase gerak      : Metanol-THF-bufer fosfat (65:5:30)
3. Suhu kolom    : 30⁰C. 
4. Kecepatan alir : 0,8 mL/menit 
5. Detektor         : spektrofotometer UV 229 nm
6. Volume injeksi : 50 μL.

Perhitungan Kadar

Nilai rata-rata luas kromatogram sampel (y) dimasukkan ke dalam persamaan kurva baku yang diperoleh untuk selanjutnya dihitung konsentrasi diazepam yang ada dalam sampel darah.

 

Referensi :

• Lunn, G and Schmuff, N.R., 1997, HPLC Methods for Pharmaceutical Analysis, Jhon Wiley and Sons, USA, p. 458. 
• Dollery, C, Therapeutic Drugs, 2^nd Edition, D80-D82. Churchil Livingstone, London 
• Lacy, C.F., et al, 2003, Drug Information Handbook, 403-405, Lexi-Comp Inc., Canada

Read More

Pengenceran Larutan

Larutan didefinisikan sebagai campuran yang homogen antara 2 macam zat ataupun lebih. Larutan terdiri dari pelarut dan zat terlarut. Umumnya zat terlarut jumlahnya lebih sedikit dibanding pelarut. Sedangkan pelarut bisa berupa air ataupun cairan organik seperti metanol, etanol, aseton dan lain-lain.
Pengenceran pada prinsipnya hanya menambahkan pelarut saja, sehingga jumlah mol zat terlarut sebelum pengenceran sama dengan jumlah mol zat terlarut sesudah pengenceran. Dengan kata lain jumlah mmol zat terlarut sebelum pengenceran sama dengan jumlah mmol zat terlarut sesudah penegenceran atau jumlah gr zat terlarut sebelum pengenceran sama dengan jumlah gr zat terlarut sesudah pengenceran.
Rumus sederhana pengenceran sebagai berikut :

M1V1 = M2V2

M1 = Molaritas larutan sebelum pelarutan
V1 =  Volume larutan sebelum pelarutan
M2 = Molaritas larutan sesudah pelarutan
V2 = Volume Molaritas larutan sesudah pelarutan

Misal jika kita akan membuat 500 ml HCl 2 M menggunakan HCl 4 M maka penggunaan rumus pengencerannya adalah 4 M x V1 = 2 M x 500 ml
maka V1 = 250 ml, artinya ambil HCl 4 M sebanyak 250 ml addkan dengan air hingga 500 ml. Sedang pada praktek pengencerannya : masukkan air dulu sebanyak kurang dari 250 ml baru ditambahkan 250 ml HCl 4 M lalu tinggal diaddkan dengan air hingga batas labu takar 500 ml. Praktek perlakuan seperti ini dimaksudkan agar tidak menimbulkan letupan untuk pengenceran asam pekat.

Prinsip Cara Mengencerkan

1. Lakukan perhitungan pengenceran
2. Masukan larutan pekat ke labu takar (dengan pemipetan)
3. Tambahkan pelarut sampai leher labu takar
4. Gojok hingga homogen
5. Tambahkan pelarut sampai batas
6. Tutup dan gojok lagi

Alat Pengenceran

Labu takar berbagai ukuran

Cara pengenceran larutan bisa menggunakan alat pipet atau labu takar. Penggunaan labu takar akan lebih tepat dalam penaraan volume. Bila menggunakan labu takar, rawat alat dengan cara mencuci dengan sabun lunak dan bilas dengan air kran diikuti akuades. Kemudian biarkan kering sebelum digunakan kembali. Pengeringan labu takar jangan didalam oven.

Pembacaan Miniskus

1. Letakkan labu takar pada tempat datar
2. Posisi mata sejajar dengan tanda batas
3. Untuk bentuk cekung, batas bawah cekungan tepat pada garis batas (misal air)
4. Untuk cembung, batas atas cembungan tepat pada garis batas (misal Hg)

Beberapa satuan konsentrasi
Jika membuat campuran konsentrasi yang berbeda, rumusnya seperti ini :

• Fraksi mol (X) : perbandingan jumlah mol suatu zat dalam larutan terhadap jumlah mol seluruh zat dalam larutan.
• Kemolaran (M) : jumlah mol zat terlarut dalam per liter larutan.
• Kemolalan (m) : jumlah mol zat terlarut dalam per 1000 gram penaraan bobot pelarut.
• Kenormalan (N) : jumlah grek zat terlarut dalam perlliter larutan.
• Persentase (%) : jumlah gram zat terlarut dalam tiap 100 ml larutan atau 100 gr penaraan bobot.

Untuk persentase, rumus perhitungan begini :
                            gram zat terlarut x 100 %
                   % = ------------------------------       
                                  gram larutan

(jika satuannya % b/b) ; (baca : persen berat per berat)

macam satuan persen lain :
% b/v (berat per volume)
% v/b (volume per berat)
% v/v (volume per volume)

X = mol suatu zat : mol seluruh zat
M = mol : liter = mmol : ml
M = (1000 : p) X (gram : BM)
N = grek : liter = mgrek : ml
Grek = mol x jumlah H+ atau OH-
                           
Larutan Elektrolit 
Definisinya adalah suatu zat yang jika dilarutkan ke dalam air akan terurai menjadi ion-ion (terionisasi) sehingga dapat menghantarkan listrik.

Elektrolit kuat akan terurai seluruh zat menjadi ion-ion (terionisasi sempurna) sedang elektrolit lemah tidak mampu menguraikan seluruh zat dalam air menjadi ion-ion artinya hanya terionisasi sebagian saja.
Contoh elektrolit kuat antara lain asam-asam kuat ( asam halogen, HNO3, H2SO4 ), basa-basa kuat ( basa alkali, Sr(OH)2, Ba(OH)2 ). Untuk bentuk garam, hampir semuanya merupakan elektrolit kuat. Salah satu ciri dari elektrolit kuat adalah mempunyai reaksi berkesudahan (berlangsung sempurna ke arah kanan).
Sedang untuk elektrolit lemah contohnya adalah asam-asam lemah, basa-basa lemah. Untuk garam yang tergolong elektrolit lemah adalah garam merkuri (II). Elektrolit lemah mempunyai reaksinya kesetimbangan (elektrolit hanya terionisasi sebagian).
                                     V1 M1 + V2M2
              M camp = -------------------
                                  V1 + V2

Read More

Analisis Dexametason

Deksametason (dexamethasone) merupakan glukokortikoid sintetis yang memiliki efek antiinflamasi, antirematik antialergi dan anti shock yang sangat kuat. Tidak menimbulkan efek retensi natrium dan dapat diterima oleh tubuh dengan baik.
Sedang efek samping yang sering dijumpai pada pemakaian jangka lama adalah berupa tukak lambung, osteoporosis, kelemahan otot, moon face, mual atau muntah, glaukoma, retensi natrium dan cairan dan reaksi hipersensitif pada kulit.
Kemasan deksametason ada yang berupa oral (pil) ataupun krim.
Analisis mengenai deksametason dalam bentuk krim dengan metode HPLC adalah sebagai berikut :

• Kolom : MetaSil ODS ( 250 mm x 4,6 mm i.d; ukuran partikel 5 μm).
• Fase gerak metanol-air (65: 35) secara isokratik.
• Kecepatan alir fase gerak : 1,0 mL/menit.
• Volume injeksi : 20 μL
• Detektor : UV 254 nm

Dengan sistem di atas, deksametason terpisah dengan baik dari pengawet metil paraben dan propil paraben dengan kromatogram seperti berikut 

Kromatogram krim yang mengandung deksametason asetat. (A) metil paraben; (B) propil paraben; (C) deksametason asetat.

Penyiapan sampel:

Sejumlah krim yang mengandung kurang lebih 3 mg deksametason asetat ditimbang secara seksama lalu dipindahkan ke dalam labu takar 100 mL dan ditambah dengan 20 mL metanol dan diencerkan sampai batas tanda dengan metanol. Larutan selanjutnya disaring dan sebanyak 20 μL larutan diinjeksikan ke sistem kromatografi.

Analisis Campuran Deksametason dan Trimetoprim

(dalam sediaan tablet)

Kondisi operasional alat :

• Kolom : LichroCART C18 (125 mm x 4,6 mm i.d; ukuran partikel 5 μm).
• Fase gerak : buffer fosfat 0,01 M pH 3,0-asetonitril (25: 75 v/v) secara isokratik.
• Kecepatan alir fase gerak : 1,0 mL/menit.
• Volume injeksi : 20 μL.
• Detektor : UV 242 nm (untuk deksametason) dan 230 nm (untuk trimetoprim).

Dengan sistem ini, deksametason dan trimetoprim terpisah dengan baik seperti kromatogram berikut :

Kromatogram yang diperoleh dari sampel tablet.

Penyiapan sampel:

Sebanyak 20 tablet ditimbang seksama dan digerus halus. Sejumlah tertentu serbuk yang setara dengan 1 tablet ditimbang secara seksama, dipindahkan ke dalam labu takar 25 mL, ditambah dengan etanol dan air hingga konsentrasi etanol 16 %. Dilakukan pengenceran hingga diperoleh respon detektor berada pada kisaran respon detektor kurva kalibrasi. Larutan disaring dengan penyaring membran 0,45 mikron dan sebanyak 20 μL diinjeksikan ke dalam sistem HPLC di atas.

Kurva kalibrasi disiapkan pada kisaran konsentrasi 0,32-32 mg/mL masing-masing untuk deksametason dan trimetoprim.

Read More

Analisis Asetaminofen (Paracetamol)

Asetaminofen yang sering disebut orang dengan istilah Paracetamol merupakan golongan obat antipiretik-analgesik paling laku dan dianggap paling aman digunakan. Namun demikian analisis parasetamol untuk penetuan kontrol kualitas, uji farmakokinetik maupun penetapan waktu kedaluwarsa sangat diperlukan.
Metode analisis bisa menggunakan metode TLC (Thin Layer Chromatography) maupun HPLC (High Performance Liquid Chromatography). Cara penetapan kadar parasetamol metode HPLC lengkap dengan kondisi operasional dan cara preparasi sampelnya adalah sebagai berikut :

• Kolom : Hypercarb (10 cm x 0,46 cm i.d., yang dikemas dengan karbon grafit porous berukuran partikel 7 mikron).
• Fase gerak : asetonitril - bufer kalium fosfat 0,05 M (pH 5,5) (80:20 v/v) dan dihantarkan secara isokratik.
• Kecepatan alir fase gerak : 1,0 mL/menit.
• Volume injeksi : 20 μL
• Detektor : UV 244 nm

Dengan system diatas, asetaminofen dapat terpisah dengan senyawa-senyawa yang terkait (4-aminofenol dan 4-klorasetanilid) dengan kromatogram seperti ini :


Pemisahan 4-aminofenol, parasetamol, dan 4-kloroasetanilid dengan sistem di atas. Puncak 1= 4-aminofenol, puncak 2 = parasetamol, dan puncak 3 = 4-kloroasetanilid.

Bila menggunakan metode TLC, preparasi dan kondisi operasinya sebagai berikut :

Fase diam    : Silika gel

Fase gerak    : Heksan-aseton (75: 25)

Deteksi        : UV

Penyiapan sampel:

Sebanyak 1 g sampel dipindahkan ke dalam tabung sentrifus gelas 15 mL bertutup rapat lalu ditambah dengan 5 mL eter, digojog selama selama 30 menit, kemudian disentrifus selama 15 menit pada 1000 rpm.

Analisis campuran Asetaminofen, Kafein dan Dehidrokodein Fosfat
(dalam Sediaan Tablet)

Kondisi operasional alat instrumen HPLC menjadi seperti berikut :

• Kolom : Chemcosorb 7-ODS-H ( 250 mm x 4,6 mm i.d; ukuran partikel 5 μm). Kolom diatur suhunya pada 40⁰C.
• Fase gerak : metanol-larutan natrium 1-heptansulfonat 5 mM dalam air (2: 3) yang mengandung asam asetat 0,5 ml/L secara isokratik.
• Kecepatan alir fase gerak : 0,7 mL/menit.
• Volume injeksi : 20 μL
• Detektor : UV 286 nm

Dengan sistem ini, asetaminofen, kafein, dan dehidrokodein fosfat dapat terpisah dengan baik menjadi seperti berikut :

Jenis kromatogram asetaminofen (1), kafein (2), dehidrokodein fosfat (3), dan fenasetin (4) dalam larutan standar (a) dan dalam ekstrak sediaan tablet (b).

Preparasi sampel:
Sebanyak 20 tablet ditimbang secara seksama lalu diserbuk halus. Sejumlah tertentu serbuk yang setara dengan 450 mg asetaminofen, 60mg kafein anhidrat, dan 9 mg dihidrokoein fosfat ditimbang secara seksama lalu dipindahkan ke dalam labu takar 50,0 mL dan diencerkan sampai batas tanda dengan metanol. Larutan selanjutnya diperlakukan dalam suatu penangas ultrasonik selama 30 menit. Setelah sentrifugasi selama 5 menit pada 2000 xg, sebanyak 5,0 mL supernatan ditambah dengan 5 ml larutan standar internal fenasetin yang berkonsentrasi 1 mg/mL. Larutan selanjutnya diencerkan sampai 50,0 mL dengan fase gerak.


Analisis Campuran Asetaminofen, Kafein dan Kodein Fosfat.
(Dalam sediaan tablet)
Untuk paracetamol dalam bentuk campuran dengan kafein dan codein phosphat, kondisi operasional alat menjadi seperti berikut :

• Kolom : μBondapack C8 ( 250 mm x 4,6 mm i.d; ukuran partikel 5 μm), yang dilengkapi dengan kolom pengaman Bondapak C18 10 mikron.
• Fase gerak : KH2PO4 0,01 M-metanol-asetonitril-isopropil alkohol (420: 20: 30: 30) dan dihantarkan secara isokratik.
• Kecepatan alir fase gerak : 1,0 mL/menit.
• Volume injeksi : 20 μL
• Detektor : UV 215 nm

Dengan sistem seperti ini, asetaminofen dapat terpisah dengan baik dari kafein dan kodein fosfat dalam waktu kurang dari 10 menit seperti gambar berikut :

Kromatogram kodein fosfat (I), parasetamol (II), dan kodein fosfat (III)
dalam suatu formulasi tablet analgesik-antipiretik dengan menggunakan sistem kromatografi di atas.

Preparasi sampel:
Sebanyak 20 tablet yang mengandung parasetamol, kafein, dan kodein fosfat ditimbang secara seksama lalu diserbuk dalam mortir. Sejumlah tertentu serbuk yang setara dengan parasetamol (500 mg), kafein (15 mg), dan kodein fosfat (10 mg) ditimbang secara seksama lalu dilarutkan dalam 50 mL fase gerak dalam labu takar 100 mL. Setelah dijaga selama 5 menit dalam penangas ultrasonik, larutan ditepatkan sampai 100 mL. Sebanyak 5,0 mL larutan ini disaring melalui penyaring 0,45 mikron lalu diencerkan 10 kali dengan fase gerak dan diinjeksikan ke dalam sistem kromatografi.

Read More