Pemilihan Fase Gerak (Eluen) KLT

Selain memilih fase diam (TLC plate), memilih eluen pengembang kromatografi lapis tipis (KLT) juga merupakan faktor yang berpengaruh besar, karena hanya beberapa kasus solvent pengembang yang hanya terdiri dari satu komponen saja. Pada umumnya campuran larutan pengembang KLT (solvent system) bisa sampai enam komponen dengan perbandingan tertentu.

Campuran larutan/eluen pengembang KLT ini berfungsi untuk :

1. melarutkan campuran bahan
2. mengangkut bahan untuk dipisahkan pada lapisan fase diam (sorben)
3. memberikan nilai hRf senyawa yang terpisah 
4. memberikan selektivitas yang memadai untuk campuran bahan untuk dipisahkan.

Adapun syarat eluen KLT (mobile phase) antara lain :

• kemurnian yang memadai
• stabilitas yang memadai
• viskositas rendah
• partisi/pemisahan linier  
• tekanan uap sedang  
• daya toksik yang serendah mungkin

Dalam pelaksanaannya, yang paling sulit dilakukan adalah bagaimana memilih solvent system/fase gerak yang cocok agar komponen senyawa terpisah baik. Cara memilih fase gerak KLT bisa dilakukan sendiri dengan orientasi dari beberapa komponen pelarut dan perbandingan. Namun demikian  untuk mendapat hasil yang memuaskan juga butuh waktu lama. Optimasi fase gerak KLT ini bisa juga sesuai mengambil dari literatur. Apabila dari literatur belum cocok pemisahan senyawanya, bisa dirubah rasio/perbandingan solvennya. Namun terkadang juga dari literature masih menuliskan sistem pelarut pengembang yang sangat beracun atau karsinogenik, misalnya benzene. Jika menggunakan komponen pengembang seperti ini perlu diperhatikan alat safety bagi pengguna.

Seri buku eluotropic memperkenalkan pengganti benzena yang bisa diganti toluene yang sesuai dengan kekuatan elusi dan koefisien kecepatannya.

Tips praktis memilih eluen pengembang KLT adalah mencari dari literatur. Apabila tidak ditemukan fase gerak yang cocok, bisa mencoba mulai dari solvent tunggal yang mempunyai kekuatan elusi menengah. Biasanya sebagai fase diam dicoba dulu menggunakan silica gel 60, sebelum dilanjutkan pengujian lain atau perubahan. Saran saya, jangan terlalu yakin eluen dari referensi sebelum anda mencobanya sendiri.

Berikut ini adalah data relatif kemampuan kecepatan pengembangan pelarut (Eluotropic series) :

No.	Solvent	mm2/detik
1.	n-Heptane	11,4
2.	n-Hexane	14,6
3.	n-Pentane	13,9
4.	Cyclohexane	6,7
5.	Toluene	11,0
6.	Chloroform	11,6
7.	Dichloromethane	13,2
8.	Diisopropyl ether	13,2
9.	tert-Butanol	1,1
10.	Diethyl ether	15,3
11.	Acetonitrile	15,4
12.	Isobutanol	1,6
13.	Isobutyl methyl ketone	9,1
14.	2-Propanol	2,5
15.	Ethyl acetate	12,1
16.	1-Propanol	2,9
17.	Ethylmethyl ketone	13,9
18.	Acetone	16,2
19.	Ethanol	4,2
20.	1,4-Dioxan	6,5
21.	Tetrahydrofuran	12,6
22.	Methanol	7,1
23.	Pyridine	8,0

Kondisi operasional diatas dikembangkan dengan :
Penjerap/fase diam : TLC-plate silica gel 60 F₂₅₄ Merck
Chamber                 : Normal dengan penjenuhan
Temperatur ruang    : 22°C
Jarak Pengembangan: 100 mm

Bahkan ketika menggunakan eluen dengan komponen tunggal dapat memberikan variasi hasil jika tidak memperhitungkan kemurniannya artinya asal pelarut murni. Beberapa diantaranya seperti chloroform, methanol, tetrahidrofuran, dll, yang mengandung tambahan stabilisator.  Ini terjadi pada grade solvent yang sama tapi berbeda produsen atau grade solvent yang berbeda dari produsen yang sama.

Contoh dibawah ini adalah kromatogram diosgenin, β-sitosterol dan lanosterin yang dielusi menggunakan chloroform dengan grade berbeda. Kasus pertama dengan chloroform LiChrosolv yang distabilkan dengan pentene dan yang kedua menggunakan chloroform PFA (pure for analysis) yang distabilkan dengan etanol.

Pengaruh stabilisator dalam eluen chloroform.

Stabilisator chloroform gambar (a) : amylene

                                             (b) : etanol

Fase diam	HPTLC RP-18 WF254S
Jarak pengembangan	7 cm
Fase gerak	Chloroform
Sampel	1.    Diosgenin 2.    β-sitosterol 3.    Lanosterin
	(masing-masing 0,2%)
Volume spoting	200 nl
Pereaksi	MnCl2/H2SO4 (5 menit pada 110°C)
Scanning	UV 265 nm, II TLC Scanner (CAMAG)

Dalam metode DAB, uji identitas untuk bunga camomile juga dilakukan dengan menggunakan

kloroform p.f.a. (DAB nomenklatur: R kloroform) sebagai pelarut. Dengan persentase rendah air dapat menyebabkan pembentukan lebih awal pada pengembangan (gambar A).

Di sisi lain, kloroform difiltrasi dengan natrium sulfat sebelum dimasukkkan dalam chamber pengembangan yang ditunjukkan pada gambar B.

A                                       B

Satu hal yang perlu diperhatikan adalah setiap eluasi pada KLT sebaikknya menggunakan eluen yang baru sehingga nilai Rf senyawa terpisah akan selalu tetap. Kecuali pada penggunaan eluen tunggal (single-component system), akan tetapi eluen tunggal jarang digunakan dalam KLT.

Posted in: TLC (KLT)