Jaman dahulu, kromatografi kertas banyak digunakan untuk
analisis flavonoid, tapi sekarang lebih banyak menggunakan metode analisis yang
sederhana dan murah yaitu Kromatografi Lapis Tipis (KLT/TLC). Kelebihan KLT ini adalah :
- Proses pemisahan senyawa yang relatif pendek.
- Cara deteksinya cukup dengan pereaksi semprot.
- Bisa menganalisis dalam beberapa sampel dalam waktu yang bersamaan.
Flavonoid memiliki dua cincin benzene yang dipisahkan oleh propana
dan merupakan turunan dari flavon. Secara umum, senyawa flavonoid larut
dalam air. Semakin banyak senyawa
terkonjugasi semakin berwarna cerah. Didalam tanaman, flavonoid
umumnya ditemukan dalam bentuk glikosida. Perbedaan klasifikasi flavonoid
ditunjukkan oleh adanya tambahan kandungan oksigen, cincin heterosiklik dan
gugus hidroksil. Kelompok ini antara lain katekin,
leucoanthocyanidin, flavanon, flavanonol,
flavon, antosianidin, flavonol, chalcone, aurone dan isoflavon.
Ada banyak macam sistem pelarut/eluen yang digunakan untuk
pemisahan flavonoid menggunakan KLT. Salah satu contoh hasil metilasi atau
asetilasi flavon dan flavonol membutuhkan pelarut
nonpolar seperti kloroform-metanol (15:1). Sedang
aglikon flavonoid seperti apigenin, luteolin dan quercetin dapat dipisahkan
dengan chloroform metanol (96:4) atau dengan polaritas yang sama. Secara umum, mobile phase KLT untuk glikosida flavonoid adalah etil asetat - asam formiat - asam
asetat glasial - air (100:11:11:26). Jika dengan penambahan etil metil keton (etil
asetat-etil metil keton-asam formiat- asam aseta glasial - air (50:30:7:3:10),
rutin dan vitexin-2''-O-ramnosida dapat dipisahkan.
Berkenaan
dengan deteksi, spot flavonoid pada pelat KLT menghasilkan kuning-coklat bintik
latar belakang putih bila direaksikan dengan uap yodium.
Flavonoid dapat muncul sebagai bintik gelap dengan latar belakang hijau berpendar bila diamati pada sinar UV 254 nm pada pelat berisi indikator UV-fluorescent (seperti silika gel F254). Jika dibawah sinar UV 365 nm, warna spot flavonoid tergantung strukturnya, bisa kuning hijau atau biru fluoresen. Akan lebih jelas dan intensif setelah disemprot dengan pereaksi.
Flavonoid dapat muncul sebagai bintik gelap dengan latar belakang hijau berpendar bila diamati pada sinar UV 254 nm pada pelat berisi indikator UV-fluorescent (seperti silika gel F254). Jika dibawah sinar UV 365 nm, warna spot flavonoid tergantung strukturnya, bisa kuning hijau atau biru fluoresen. Akan lebih jelas dan intensif setelah disemprot dengan pereaksi.
Warna
yang bisa diamati pada sinar UV 365 nm adalah sebagai berikut :
- Quercetin, myricetin, dan 3 & 7-O-glikosida : oranye-kuning
- Kaempferol, isorhamnetin, dan 3 & 7-O-glikosida : kuning-hijau
- Luteolin dan 7-O-glikosida : orange
- Apigenin dan 7-O-glikosida : kuning-hijau
Rincian lebih lanjut mengenai penggunaan reagen produk
bahan alam dapat dilihat diartikel Brasseur dan Angenot, 1986, hal 351.
Ferri chloride dalam air atau etanol merupakan penampak bercak secara umum pada analisis senyawa fenolik akan memberikan warna biru-hitam pada deteksi flavonoid. Demikian pula Fast Blue Salt B membentuk warna biru atau biru ungu.
Ferri chloride dalam air atau etanol merupakan penampak bercak secara umum pada analisis senyawa fenolik akan memberikan warna biru-hitam pada deteksi flavonoid. Demikian pula Fast Blue Salt B membentuk warna biru atau biru ungu.
Inilah daftar eluen KLT untuk pemisahan flavonoid pada fase
diam silica gel :
Sampel
|
Eluen
|
Flavonoid
aglycon
|
EtOAc–Isopropanol–H2O, 100:17:13
EtOAc– Chloroform, 60:40
Chloroform–MeOH, 96:4
Toluene– Chloroform –MeCOMe, 8:5:7
Toluene–HCOOEt–HCOOH, 5:4:1
Toluene–EtOAc–HCOOH, 10:4:1
Toluene–EtOAc–HCOOH, 58:33:9
Toluene–EtCOMe–HCOOH, 18:5:1
Toluene–dioxane–HOAc, 90:25:4
|
Flavonoid
glycoside
|
n-BuOH–HOAc–H2O, 65:15:25
n-BuOH–HOAc–H2O, 3:1:1
EtOAc–MeOH–H2O, 50:3:10
EtOAc–MeOH–HCOOH–H2O, 50:2:3:6
EtOAc–EtOH–HCOOH–H2O, 100:11:11:26
EtOAc–HCOOH–H2O, 9:1:1
EtOAc–HCOOH–H2O, 6:1:1
EtOAc–HCOOH–H2O, 50:4:10
EtOAc–HCOOH–HOAc–H2O, 100:11:11:26
EtOAc–HCOOH–HOAc–H2O, 25:2:2:4
THF–toluene–HCOOH–H2O, 16:8:2:1
Chloroform –MeCOMe–HCOOH, 50:33:17
Chloroform –EtOAc–MeCOMe, 5:1:4
Chloroform –MeOH–H2O, 65:45:12
Chloroform –MeOH–H2O, 40:10:1
MeCOMe–butanone–HCOOH, 10:7:1
MeOH–butanone–H2O, 8:1:1
|
Flavonoid
glucuronide
|
EtOAc–Et2O–dioxane–HCOOH–H2O,
30:50:15:3:2
EtOAc–EtCOMe–HCOOH–H2O, 60:35:3:2
|
Flavanone
aglycone
|
CH2Cl2–HOAc–H2O, 2:1:1
|
Flavanone
glycoside
|
Chloroform –HOAc, 100:4
Chloroform –MeOH–HOAc, 90:5:5
n-BuOH–HOAc–H2O, 4:1:5 (upper layer)
Chalcones EtOAc–hexane, 1:1
Isoflavones CHCl3–MeOH, 92:8
Chloroform –MeOH, 3:1
|
Isoflavone
glycoside
|
n-BuOH–HOAc–H2O, 4:1:5 (upper layer)
|
Dihydroflavonol
|
Chloroform –MeOH–HOAc, 7:1:1
|
Biflavonoid
|
Chloroform –MeCOMe–HCOOH,
75:16.5:8.5
Toluene–HCOOEt–HCOOH, 5:4:1
|
Anthocyanidin dan anthocyanin
|
EtOAc–HCOOH–2 M HCl, 85:6:9
n-BuOH–HOAc–H2O, 4:1:2
EtCOMe–HCOOEt–HCOOH–H2O, 4:3:1:2
EtOAc–butanone–HCOOH–H2O, 6:3:1:1
|
Proanthocyanidin
|
EtOAc–MeOH–H2O, 79:11:10
EtOAc–HCOOH–HOAc–H2O,
30:1.2:0.8:8
|
0 comments:
Posting Komentar