Analisis Flavonoid Metode TLC

Jaman dahulu, kromatografi kertas banyak digunakan untuk analisis flavonoid, tapi sekarang lebih banyak menggunakan metode analisis yang sederhana dan murah yaitu Kromatografi Lapis Tipis (KLT/TLC).  Kelebihan KLT ini adalah :

• Proses pemisahan senyawa yang relatif pendek.
• Cara deteksinya cukup dengan pereaksi semprot.
• Bisa menganalisis dalam beberapa sampel dalam waktu yang bersamaan.

KLT cocok untuk orientasi awal analisis ekstrak tumbuh-tumbuhan sebelum dilanjutkankan ke alat instrument analisis lainnya seperti HPLC, GC, dll.

Flavonoid memiliki dua cincin benzene yang dipisahkan oleh propana dan merupakan turunan dari flavon. Secara umum, senyawa flavonoid larut dalam air. Semakin banyak senyawa terkonjugasi semakin berwarna cerah. Didalam tanaman, flavonoid umumnya ditemukan dalam bentuk glikosida. Perbedaan klasifikasi flavonoid ditunjukkan oleh adanya tambahan kandungan oksigen, cincin heterosiklik dan gugus hidroksil. Kelompok ini antara lain katekin, leucoanthocyanidin, flavanon, flavanonol, flavon, antosianidin, flavonol, chalcone, aurone dan isoflavon.

Ada banyak macam sistem pelarut/eluen yang digunakan untuk pemisahan flavonoid menggunakan KLT. Salah satu contoh hasil metilasi atau asetilasi flavon dan flavonol membutuhkan pelarut nonpolar seperti kloroform-metanol (15:1). Sedang aglikon flavonoid seperti apigenin, luteolin dan quercetin dapat dipisahkan dengan chloroform metanol (96:4) atau dengan polaritas yang sama. Secara umum, mobile phase KLT untuk glikosida flavonoid adalah etil asetat - asam formiat - asam asetat glasial - air (100:11:11:26). Jika dengan penambahan etil metil keton (etil asetat-etil metil keton-asam formiat- asam aseta glasial - air (50:30:7:3:10), rutin dan vitexin-2''-O-ramnosida dapat dipisahkan.

Berkenaan dengan deteksi, spot flavonoid pada pelat KLT menghasilkan kuning-coklat bintik latar belakang putih bila direaksikan dengan uap yodium.
Flavonoid dapat muncul sebagai bintik gelap dengan latar belakang hijau berpendar bila diamati pada sinar UV 254 nm pada pelat berisi indikator UV-fluorescent (seperti silika gel F254). Jika dibawah sinar UV 365 nm,  warna spot flavonoid tergantung strukturnya, bisa kuning hijau atau biru fluoresen. Akan lebih jelas dan intensif setelah disemprot dengan pereaksi.

Warna yang bisa diamati pada sinar UV 365 nm adalah sebagai berikut :

• Quercetin, myricetin, dan 3 & 7-O-glikosida : oranye-kuning
• Kaempferol, isorhamnetin, dan 3 & 7-O-glikosida : kuning-hijau
•  Luteolin dan 7-O-glikosida : orange 
• Apigenin dan 7-O-glikosida : kuning-hijau

Rincian lebih lanjut mengenai penggunaan reagen produk bahan alam dapat dilihat diartikel Brasseur dan Angenot, 1986, hal 351.
Ferri chloride dalam air atau etanol merupakan penampak bercak secara umum pada analisis senyawa fenolik akan memberikan warna biru-hitam pada deteksi flavonoid. Demikian pula Fast Blue Salt B membentuk warna biru atau biru ungu.

Inilah daftar eluen KLT untuk pemisahan flavonoid pada fase diam silica gel :

Sampel	Eluen
Flavonoid aglycon	EtOAc–Isopropanol–H2O, 100:17:13 EtOAc– Chloroform, 60:40 Chloroform–MeOH, 96:4 Toluene– Chloroform –MeCOMe, 8:5:7 Toluene–HCOOEt–HCOOH, 5:4:1 Toluene–EtOAc–HCOOH, 10:4:1 Toluene–EtOAc–HCOOH, 58:33:9 Toluene–EtCOMe–HCOOH, 18:5:1 Toluene–dioxane–HOAc, 90:25:4
Flavonoid glycoside	n-BuOH–HOAc–H2O, 65:15:25 n-BuOH–HOAc–H2O, 3:1:1 EtOAc–MeOH–H2O, 50:3:10 EtOAc–MeOH–HCOOH–H2O, 50:2:3:6 EtOAc–EtOH–HCOOH–H2O, 100:11:11:26 EtOAc–HCOOH–H2O, 9:1:1 EtOAc–HCOOH–H2O, 6:1:1 EtOAc–HCOOH–H2O, 50:4:10 EtOAc–HCOOH–HOAc–H2O, 100:11:11:26 EtOAc–HCOOH–HOAc–H2O, 25:2:2:4 THF–toluene–HCOOH–H2O, 16:8:2:1 Chloroform –MeCOMe–HCOOH, 50:33:17 Chloroform –EtOAc–MeCOMe, 5:1:4 Chloroform –MeOH–H2O, 65:45:12 Chloroform –MeOH–H2O, 40:10:1 MeCOMe–butanone–HCOOH, 10:7:1 MeOH–butanone–H2O, 8:1:1
Flavonoid glucuronide	EtOAc–Et2O–dioxane–HCOOH–H2O, 30:50:15:3:2 EtOAc–EtCOMe–HCOOH–H2O, 60:35:3:2
Flavanone aglycone	CH2Cl2–HOAc–H2O, 2:1:1
Flavanone glycoside	Chloroform –HOAc, 100:4 Chloroform –MeOH–HOAc, 90:5:5 n-BuOH–HOAc–H2O, 4:1:5 (upper layer) Chalcones EtOAc–hexane, 1:1 Isoflavones CHCl3–MeOH, 92:8 Chloroform –MeOH, 3:1
Isoflavone glycoside	n-BuOH–HOAc–H2O, 4:1:5 (upper layer)
Dihydroflavonol	Chloroform –MeOH–HOAc, 7:1:1
Biflavonoid	Chloroform –MeCOMe–HCOOH, 75:16.5:8.5 Toluene–HCOOEt–HCOOH, 5:4:1
Anthocyanidin dan anthocyanin	EtOAc–HCOOH–2 M HCl, 85:6:9 n-BuOH–HOAc–H2O, 4:1:2 EtCOMe–HCOOEt–HCOOH–H2O, 4:3:1:2 EtOAc–butanone–HCOOH–H2O, 6:3:1:1
Proanthocyanidin	EtOAc–MeOH–H2O, 79:11:10 EtOAc–HCOOH–HOAc–H2O, 30:1.2:0.8:8