Analisis Diazepam dalam Darah

Diazepam (Valium) merupakan turunan dari benzodiazepine dengan rumus molekul 7-choro-1,3-dihydro-1-methyl-5-phenyl-2H-1,4-benzodiazepin-2-on, rumus kimianya biasa ditulis dengan C₂₃H₂₇N. Senyawa golongan psikotropika ini berbentuk kristal agak kekuningan yang tidak larut air. Nama brand diazepam dalam sediaan tunggal antara lain Valium®, Valisanbe®, Validex® dan Stesolid® dengan kemasan 2 mg, 5 mg dan 10 mg. Ada juga dalam sediaan campuran/kombinasi seperti Metaneuron®, Danalgin® dan Neurodial®.

Diazepam termasuk obat  antiansietas, antikonvulsan, dan sedatif. Mempunyai Indikasi untuk status epileptikus, ansietas atau insomnia, konvulsi akibat keracunan, kejang demam, dan sebagai obat penenang.

Uji farmakokinetika menunjukkan absorpsi diazepam dengan cepat secara lengkap setelah pemberian peroral dengan konsentrasi puncak dalam plasma yang dicapai pada menit ke 15-90 pada dewasa dan menit ke-30 pada anak-anak. Bioavailabilitas obat dalam bentuk sediaan tablet adalah 100%. Range t_1/2­  diazepam antara 20-100 jam dengan rata-rata t_1/2­nya adalah 30 jam,  sedang waktu paruh bervariasi antara 20 - 50 jam.

Didalam tubuh, diazepam dimetabolisme menjadi metabolit aktif yaitu N-desmetildiazepam dan oxazepam. Sedang waktu paruh desmetil-diazepam bervariatif sampai 100 jam tergantung usia dan kondisi fungsi hati.

Cara penetapan kadar diazepam dalam darah adalah dengan menggunakan metode HPLC (High Performance Liquid Chromatography). Prinsip cara uji diazepam ini adalah dengan mengekstraksi menggunakan pelarut atau campuran pelarut yang sesuai. Kemudian sampel yang sudah melalui proses  preparasi selanjutnya diinjeksikan ke sistem HPLC.

Bahan Preparasi :

Rumus Bangun Diazepam

1. Bufer fosfat 10 mM, yang dibuat dengan melarutkan 680 mg KH₂PO₄ dalam 1 liter air, pH diatur 2,6 dengan menambah asam orto-fosfat pekat. 
2. Bufer ammonia, dibuat dengan ammonium sulfat jenuh yang diencerkan dengan air hingga konsentrasi 25% lalu pH-nya diatur 9,5 dengan ammonia 25%. 
3. Kloroform 
4. Isoropanol 
5. n-heptan 
6. Tetrahidrofuran (THF) 
7. Metanol 
8. Air

Peralatan yang dipakai :

1. Seperangkat alat HPLC 
2. Neraca analitik 
3. pH-meter 
4. Alat sentrifuge

Prosedur Penyiapan (preparasi) Larutan Sampel :

1. Sebanyak 2 mL darah atau 2 mL plasma ditambah dengan 2 mL buffer ammonia, 5 mL campuran kloroform-isopropanol-n-heptan dengan perbandingan 60:14:26.
2. Campuran digojog secara horizontal selama 10 menit, lalu disentrifus dengan kecepatan 2800 xg selama 10 menit.Lapisan organic (bagian bawah) dipindahkan dan diuapkan sampai kering di bawah vakum pada suhu 45⁰C.
3. Residu dilarutkan kembali dalam 100 μL fase gerak lalu disentrifus lagi dengan kecepatan 2800 xg selama 5 menit. 
4. Alikuot supernatannya diambil untuk diinjeksikan ke dalam system HPLC.

Cara Penetapan

1.  Dibuat kurva baku diazepam dengan menggunakan matriks plasma yang bebas diazepam pada kisaran konsentrasi 1-100 μg/mL atau pada kisaran konsentrasi yang memberikan reson detektor yang linier. 
2. Masing-masing konsentrasi diinjeksikan dengan sistem HPLC seperti dibawah dan diulangi sebanyak 3 kali.
3. Dihitung persamaan kurva baku y = a+bx; dimana y = luas kromatogram dan x = konsentrasi baku yang diinjeksikan.
4. Sebanyak 50 μL alikuot supernatan diinjeksikan ke dalam sistem HPLC dan dicatat luas kromatogramnya.
5. Injeksikan sampel dengan replikasi sebanyak 4 kali dan dihitung nilai rata-rata luas kromatogramnya.

Sistem kromatografi yang digunakan :

1. Kolom            : NovaPack C₁₈ (300 x 3,9 mm) 
2. Fase gerak      : Metanol-THF-bufer fosfat (65:5:30)
3. Suhu kolom    : 30⁰C. 
4. Kecepatan alir : 0,8 mL/menit 
5. Detektor         : spektrofotometer UV 229 nm
6. Volume injeksi : 50 μL.

Perhitungan Kadar

Nilai rata-rata luas kromatogram sampel (y) dimasukkan ke dalam persamaan kurva baku yang diperoleh untuk selanjutnya dihitung konsentrasi diazepam yang ada dalam sampel darah.

 

Referensi :

• Lunn, G and Schmuff, N.R., 1997, HPLC Methods for Pharmaceutical Analysis, Jhon Wiley and Sons, USA, p. 458. 
• Dollery, C, Therapeutic Drugs, 2^nd Edition, D80-D82. Churchil Livingstone, London 
• Lacy, C.F., et al, 2003, Drug Information Handbook, 403-405, Lexi-Comp Inc., Canada